细胞计数方法

细胞培养操作中，细胞计数是不可或缺的操作，那样细胞计数该怎么操作呢？下面就让上海市巴拓仪器有限公司为大家介绍一下。

1，最先备好细胞计数器(血球计数板)

应用70%酒精将盖玻片和细胞计数板清理、晾晒预留。

将晒干的盖玻片轻轻地遮盖至血细胞计数机中。

(注：使用时须确保盖玻片和计数板已充足晾晒，否则就会危害后面细胞充池及计数结论。)

2，制取细胞悬浮液

针对贴壁生长细胞，我们应该最先应用胰酶消化方式使细胞从细胞培养皿表层掉下来。(飘浮细胞也无需消化吸收，稀释液到适宜倍率就可以。)

然后加入适度的含血清蛋白培养液，中合胰水解作用并举悬细胞，以获得匀质的细胞悬浮液。规定尽量将细胞飘散，不必残余一切细胞团，但不能用劲太大。

(注：消化吸收过于或消化吸收不完整均会让计数结论造成误差。)

台盼兰染色(可选择)：

必要时测算细胞的活动力，就需要将细胞悬浮液和0.4%台盼兰等体积混合;

室内温度孵化3-5min(飘浮细胞染色时长可视性状况适当增加)，使台盼兰彻底进到死细胞，使死细胞着深蓝色。

3，血细胞计数器加样

应用塑料吸管或加样器将细胞悬浮液或细胞/台盼兰混合物滴入到计数池边沿。这时液体将于虹吸式的影响下进到盖玻片下方计数池，此即是充池。

(注：如要开展好几个样品计数，应尽量保持每一次充池容积一致，一般在10μl/池上下。)

用同样的方式为另一侧的计数池里也加入了计数试品。

将计数板静放数分钟使细胞蔓延、地基沉降。

4，细胞计数

在100倍高倍显微镜，挪动计数板将视线指向计数板中间大方块，该格子四周有一圈3条直线包围着，中间是集中的网格图。中间格子区类似正好可以铺满全部视线(下面的图标识的3号部位)。

各自计数大方格1.2.4.5里的细胞数。(为了降低计数偏差，最好把细胞浓度值调整至20-50个/大方格。)并重复记录另一侧计数池里的细胞数，累计8个大方块，随后取平均值。

计数标准为：“数中不数下，数左不数右”。(判定标准为是不是触碰三条边框线的分隔线，如图所示)

假如有好几个细胞并没有飘散而结团存有，这时只能记作一个细胞。假如包块许多，则需要再次吹打乃至再次抽样消化吸收直到绝大部分细胞为单独细胞。

5，细胞浓度值

由图中可以得出，每一个大方格的容量为：

1 mm2×0.1 mm=0.1 mm3=10-4 cm3=10-4 ml

即每一个大方格的容量为万分之一mL，因而在预估每毫升液态里的细胞数时要乘于104。

在普通未使用台盼兰染色时，可以通过下边公式换算每毫升样本中细胞的数量：

每毫升样本中细胞的数量=每一个大方格内细胞的平均值 × 细胞稀释倍数×104

如果采用了台盼兰染色，还要测算活细胞的百分比：

活细胞百分比(%)=台盼兰拒染细胞数/总细胞数×100

这时活细胞数字的计算公式：

每毫升样本中活细胞的数量=每一个大方格中细胞的平均值×活细胞比例×细胞稀释倍数×2×104

注：乘2主要是因为在台盼兰染色时，展开了等体积混合，等同于稀释液了一倍。

看过之上流程和机理，大伙儿禁不住要问：为什么一定要数细胞啊?细胞计数到底有哪些作用呢?实际上，在我们想知道细胞生长状况时，除开立即观查细胞形状之外，制作细胞生长曲线图、测算细胞增长时长当然就是广泛采用的评价指标体系了。

所以虽然应用血细胞计数板手工制作计数细胞全过程十分繁杂，对试验者操作者规定也非常严格，现在都已经有许多自动化细胞计数器/仪，但是对于科研中所遇到的细胞来讲，手工制作计数依然是很简单易行的办法所以被众多试验室选用。