生物显微镜切片制作方法

生物显微镜切片制作方法：

取材-分割-固定-洗涤-脱水-透明-浸蜡和埋蜡-切片-粘片-脱蜡-染色-脱水-透明-封片

1 、固定液

( 1 )FAA ：福尔马林一冰醋酸一酒精

50 ％或 70 ％乙醇 90ML+冰醋酸 5ml+福尔马林（37 ％- 40％甲醛）5ml

固定时间最短需10h，一般不低于24h，可兼做保存液

幼嫩材料用 50 ％酒精代替70 ％酒精，可防止材料收缩。如材料坚硬，可略减冰醋酸，略增福尔马林；如材料易收缩，可稍增冰醋酸。久置时可加5ml甘油，以防止蒸发和材料变硬。如果用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果更好：

50 ％乙醇 89mL +冰醋酸 6mL+福尔马林（37％-40％甲醛）5mL

( 2 ）卡诺氏固定液：酒精一醋酞一氯仿

配方 1 ：纯酒精 3 冰醋酸 1 (3:1)

配方 2 ：纯酒精6＋冰醋酸1+氯仿3 （或纯酒精30mL+氯仿5mL+冰醋酸10mL）一般材料不超过 24h ，固定根尖和花药只需40-60min，固定后用95％酒精（85％酒精）冲洗，每级20min,如不能立即处理，需转入70％酒精中保存。

2 、洗涤：FAA固定液无需洗涤直接脱水。

3 、脱水：材料中含水，水与石蜡不能混合，通常由50％、70％、80％、90％、无水乙醇，每次1h，其中无水乙醉需2次。材料大的需延长脱水时间（一般此后进行预染色）

4 、透明：常用透明剂为二甲苯和氯仿。先经乙醇和二甲苯混合液（1/2乙醇+1/2 二甲苯） , 后纯二甲苯（2次），每次1-2h。

氯仿不宜在染色后透明。5 级进行；1/5 氯仿（4/5无水乙醇）→ 2/5→3/5 →4/5 ，纯氯仿（ 2 次）每级3-4h；最后一次纯氯仿中，放入纯石蜡粉末数次，盖好瓶盖，36 ℃温箱36h, 使材料慢慢浸蜡。

5 、浸蜡、包埋：石蜡必须纯净、不含杂质；浸蜡是使石蜡逐渐取代透明剂

石蜡：熔点 52一56 ℃ ，一般50一60℃

选用与乙醇和石蜡均能互溶的有机溶剂，如二甲苯，温箱设置高于石蜡熔点2℃ 25％→50％→75 %（石蜡、二甲苯溶液）

材料透明好后，换入新的二甲苯，然后加入等体积的碎蜡，40℃温箱，不断加入碎蜡至饱和，然后升温保持3一5h ，其间换纯蜡3次，每次约1一2h 。（ 30min 也可）

包埋是将材料和石蜡一块倒入小盒中，用加热的镊子迅速将材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐，将小盒放入冷水中，凝固

6 、修块：包埋好的材料，按需要的切面将蜡块切成梯形，然后用蜡铲把蜡块底部牢固的粘在木质蜡座上

7 、切片：需先用切除的蜡块试刀，确定刀的斜度为5°-8°为宜。一经调整合适后吗，就不要随便动，以免每次试刀。（8-15um )

8 、粘片：在干净的载玻片上，滴一小滴蛋清甘油（或0.3％明胶水），然后加几滴 3％福尔马林或蒸馏水，用解剖针或镊子轻轻将蜡片放在液面上，再将带有蜡片的载玻片放在温台上，温台的温度在45℃左右，蜡片受热后慢慢伸直，用滤纸吸去多余液体，表面烤干，转入30℃ 温箱一昼夜

9 、脱蜡：二甲苯脱蜡。顺序：二甲苯→二甲苯→1/2 +1/2纯乙醇→100 ％乙醇→ 95%乙醇→85 ％乙醇→70 ％乙醇→50 ％乙醇→30％乙醇→蒸馏水→染色，以上每级需要5一10min

10 、染色： ( 1 ）铁帆一苏木精染色法（细胞学和胚胎学研究）

4％铁帆媒染30min→自来水洗涤数次→蒸馏水洗涤数次→苏木精染色1-2h→自来水洗涤数次→蒸馏水洗涤数次→2％铁帆分色→并在显微镜下镜检→分色后立即用自来水冲洗30min→蒸馏水洗涤数次→30％乙醇→50％乙醇→70％乙醇→85％乙醇→ 95％乙醇（尽量用吸水纸在切片边缘将溶液吸净、以免带水）→100 ％乙醇（尽量将边缘溶液吸净、以免带水）→1/2 甲苯→纯二甲苯（ 2 次）→中性树胶封片

注： ① 每道工序约3-5min② 苏木精用无水乙醇配制成 10 ％的母液，经一个月的氧化后方可使用，用时稀释到0.05 %

( 2 ）番红一固绿染色法

70 ％乙醇→1％番红6h或过夜（用 50％乙醇配制）→70 ％乙醇→85 ％乙醇→ 95％乙醇→0.5 %固绿5-30S(60S）或用滴染法（95％乙醇配制）→95％乙醇（10mm 、吸水纸吸尽边缘溶液）→100％乙醇（ l0min 、吸水纸吸尽边缘溶液）→1/2二甲苯+1 /2无水乙醇→纯二甲苯（2 次）→中性树胶封片

溶液配制： 1 ％番红溶液：1g番红，溶于99ml蒸馏水中

5％固绿溶液：取0.5g亮绿，溶解在100mL蒸馏水中

10 、脱水、透明脱水时间要短，因为乙醇有褪色作用

11 、封片

常用固封剂为加拿大树胶

固封方法： ( 1 ）准备好清洁盖片、镊子、树胶、白布等

( 2 ）用白布小心擦拭已经透明好的带有标本的载玻片，并在其上滴一滴加拿大树胶

( 3 ）用镊子夫持一个清洁的盖玻片，一端先与树胶滴接触，然后缓慢放下盖片，使整个树胶充满盖片

( 4 ）将封好的切片放至烤片夹中，放入温箱（40 ℃ ）中烘干。