荧光显微镜原理特点与使用

(一)荧光显微镜的基本原理和结构特征：荧光显微镜是运用一个高发光效率的线光源，通过正片叠底系统软件传出一定波长的光(如紫外线3650入或紫高清蓝光4200入)做为激发光、激发标本里的荧光化学物质发送出很多不同颜色荧光后，然后通过物镜和目镜的变大观察。那么在明显对衬环境下，即便荧光很薄弱也容易分辨，敏感度高，主要运用于细胞膜的结构和功能以及成分等科学研究。荧光显微镜的基本结构是通过一般显微镜加上一些配件(如荧光灯源、激发滤片、两色束分离设备和阻隔滤片等)的前提下所组成的。荧光灯源——般选用超高压钠灯(50一200W)，它可以传出各种各样波长的光，但每一种荧光化学物质都有一个造成荧光的激发光的波长，因此要加用激发滤片（一般有紫外线、蓝紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光通过照射标本上，而把别的光都吸取掉。每一种化学物质被激发阳光照射后，在极短时间发送出较直射光波长比较长的由此可见荧光。荧光具备专一性，一般都比激发光弱，为了能注意到专一的荧光，在物镜后边要加阻隔(或抑制)滤光片。它的功能有二：一是吸收阻拦激发光进到目镜、以防于扰荧光和损害双眼，二是挑选然后让特殊的荧光通过，表现出了专一的荧光颜色。二种滤光片应该选择搭配使用。

荧光显微镜从总体上激光光路来分为二种：

1．散射式荧光显微镜:激发灯源是由聚光镜越过标本原材料来激发荧光的。常见暗视野集光器，还可用一般集光器，调整后视镜使激发光转射和旁射入标本上．这也是较为老式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而主要缺点随放大倍率提高其荧光变弱．因此对观查比较大的标本原材料不错。

2．落射式荧光显微镜这也是近现代发展起来新型荧光显微镜，和上不一样的地方是激发单从物镜向降落射入标本表层，既用同一物镜做为照明灯具聚光器和搜集荧光的物镜。激光光路中应加上一个两色束分离设备，它与光铀呈45。角，激发光被反射面到物镜中，并聚在试品上，试品所形成的荧光以及为物镜镜片表层、盖玻片表层反射面的激发光同时进入物镜，反返回两色束分离设备，使激发光和荧光分离，残留激发光被阻隔滤片消化吸收。如换采用不同的激发滤片／两色束分离设备／阻隔滤片的搭配插块，可满足不同荧光反映产品的必须。此类荧光显微镜的优势是视线照明灯具匀称，显像清楚，放大倍率越大荧光愈强。

（二）荧光显微镜操作方法．

1．开启光源，超高压钠灯要加热数分钟才能达到高亮度。

2．散射式荧光显微镜需要在光源与聚光器中间安上所规定的激发滤片，在物镜后边安上对应的阻隔滤片。落射式荧光显微镜需要在激光光路的扩展槽中插进所规定的激发滤片／两色束分离设备／阻隔滤片的插块。

3．用低倍镜观查，依据不同型号荧光显微镜的调节装置，调节灯源核心，使之坐落于全部照明灯具光点的中心。

4．摆放标本片，变焦后就可以观查。使用时需要注意：末装滤光片不必保护眼睛立即观查，以免造成眼的损害；用食油镜观查标本时，务必用无荧光的独特油镜；高压钠灯关闭后不可以马上再次开启，须经5min之后才能重新启动，不然会平稳，危害汞灯使用寿命。

(三)观查 在步态分析舞台上的荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，由此可见经o．01％的丫啶橙荧光染料染色细胞，细胞质和细胞核被激发造成二种不同颜色荧光(深绿色和橘红色)。